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Introduction

タンパク質を構成するアミノ酸の配列順序を決めるのは、核酸塩基の配列順序です。 それぞれのアミノ酸は、4種の核酸塩基(A, T/U, G, C)のうち3塩基の連鎖(コドン) でコードされています。アミノ酸の種類が20種類であるのに対し、3個の塩基の並び方は 4x4x4で64通り考えられます。実際、1つのアミノ酸に複数のコドンが対応すること が知られており、このように、同一のアミノ酸をコードするコドンを 同義コドン (synonym codon)と呼びます。 同義コドンの使用頻度には、生物種固有の偏りが存在することが知られています。

ここでは、初心者向けにG-language System の使い方を解説していきます。 前提として、以上の生物学的知識と、UNIXの基本的な操作法が身についているものとします。

Step 0 - Starting up the G-language System

Here, I will explain how to use the G-language System for beginners. As a precondition, it is expected that the biological knowledge shown above, and basic UNIX operating skills are already mastered.

Now, before we start to analyze codon usage, let’s start the G-language System. If you use the G-language System, genome analysis is very simple.

For example, if you use the data file “bsub.gbk” (the complete genome of Bacillus subtilis in the Genbank form) under the current directory to analyze, you only need to input the next two lines to get ready.

use G; 
$gb = new G("bsub.gbk"); 

Let’s try and execute the following Perl script. (Please set the file name to “test.pl”)

perl test.pl  [ENTER] 

Did you get the following output?

           __/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/
              
                 G-language  Genome Analysis Environment v.1.6.10


                           http://www.g-language.org/

            Please cite: 
               Arakawa et al. (2003) Bioinformatics.
               Arakawa et al. (2006) Journal of Pestice Science.

            License: GNU General Public License
            Copyright (C) 2001-2007 G-language Project
            Institute for Advanced Biosciences, Keio University, JAPAN 

           __/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/__/


Accession Number: AL009126 

  Length of Sequence :   4214814 
         A Content :   1187757 (28.18%) 
         T Content :   1192867 (28.30%) 
         G Content :    915023 (21.71%) 
         C Content :    919167 (21.81%) 
            Others :         0 (0.00%) 
        AT Content :    56.48% 
        GC Content :    43.52% 

With the output of the Accession Number and the base content statistic, the G-language System informs that it has successfully read the data file (“bsub.gbk”).

Now, we will explain the script.

  • use G: imports module G
  • $gb = new G("bsub.gbk"); loads the file “bsub.gbk” under the current directory, and stores the annotation and the base sequence under the variable ”$gb”.

Exercise 0:

Load the complete genome data for other bacteria (such as “ecoli.gbk”, “hbsp.gbk”, and “mgen.gbk”).

{Hint} Rewrite the line $gb→new G("bsub.gbk"); on the above script.

Step1: Examples of standard function usage (1): Analyzing of codon usage among entire genes.

In the G-language System, there are several functions set for genome analysis. Now, let’s analyze codon usage for B.subtilis, using one of the standard functions “codon usage()”. Please rewrite a line using the codon usage() function in the Perl script you have created in Step0.

use G; 
$gb = new G("bsub.gbk"); 
codon_usage($gb); 

If you execute the sript, codon usage percentage should be shown on the display, and the following codon table should be displayed.

This is the chart of the calculation of the frequency of synonym codons in the B.subtilis genome. Each amino acids sum of synonym codons frequancy equals one. For example, for phenylalanine(code:F), the percentage of TTC is 0.315 compared to 0.685 for TTT. Of the two synonym codons, it heavily uses TTT. Of the three synonym codons that exist, Isoleucine(code :i) heavily uses ATT. As you can see, there is a pattern in which each amino acid is biased upon a peculiar codon.

Excercise 1:

Compare and examine the deflection of each amino acids synonym codon usage for mycoplasma genitalium (“mgen.gbk”) and B.subtilis.

[Hint] Rewrite the line $gb→new G("bsub.gbk"); in the above script.

Step2 -標準関数の使用例(2) : 遺伝子毎のコドン使用頻度の解析

G-language System の標準関数には、多彩なオプションが用意されています。 codon_usage()関数は、以下のオプションを持ちます。

optiondescription
-CDSid コドン使用頻度を計算するCDSのIDを指定。デフォルトは全遺伝子で計算する。
-output 出力先を指定。'stdout'はディスプレイ出力、'f'はファイル出力。デフォルトは 'stdout'。
-filename 出力ファイル名を指定。デフォルトは 'codon_usage.csv'。

オプションは

codon_usage($gb, -output=>'f', -filename=>'bsub_CodonUsage.csv'); 

のように、"-" をオプション名の頭に付け、"⇒" で値と結びます。

Step 1 ではゲノム全体としてのコドン使用頻度を計算しましたが、今度は ある特定の遺伝子のコドン使用頻度を計算してみましょう。

Step 1 で作成したスクリプトを以下のように書き換えて下さい。

use G; 
$gb = new G("bsub.gbk"); 
codon_usage($gb, -CDSid=>'CDS113'); 

'CDS113'は、伸長因子(elongation factor Tu, EF-Tu)をコードする遺伝子(tufA)に対応しています。 上記スクリプトを実行すると、以下に示すような tufA 遺伝子のコドン使用頻度がディスプレイに出力されるはずです。

/ → taa → 1 1.000 A → gca → 2 0.074 A → gcc → 2 0.074 A → gcg → 3 0.111 A → gct → 20 0.741 C → tgc → 2 1.000 D → gac → 15 0.600 D → gat → 10 0.400 E → gaa → 32 0.762 E → gag → 10 0.238 F → ttc → 13 1.000 G → gga → 9 0.243 G → ggc → 5 0.135 G → ggt → 23 0.622 H → cac → 7 0.583 H → cat → 5 0.417 I → atc → 19 0.760 I → att → 6 0.240 K → aaa → 19 0.864 K → aag → 3 0.136 L → cta → 1 0.043 L → ctt → 20 0.870 L → tta → 2 0.087 M → atg → 14 1.000 N → aac → 8 0.889 N → aat → 1 0.111 P → cca → 14 0.824 P → cct → 3 0.176 Q → caa → 7 0.875 Q → cag → 1 0.125 R → cgc → 6 0.300 R → cgt → 14 0.700 S → agc → 2 0.118 S → tca → 3 0.176 S → tcc → 1 0.059 S → tct → 11 0.647 T → aca → 13 0.394 T → act → 20 0.606 V → gta → 13 0.342 V → gtc → 1 0.026 V → gtt → 24 0.632 W → tgg → 1 1.000 Y → tac → 9 0.818 Y → tat → 2 0.182 total → 397

左から順に

アミノ酸の略号 → コドン → コドンの計数値 → 同義コドンの頻度 ('/'は終止コドンを意味します) を表しています。 この出力結果から、tufA 遺伝子における同義コドン使用の偏りは、 遺伝子全体の傾向とは大きく異なっていることがわかります。例えば、 フェニルアラニン(略号 : F )では2つある同義コドンのうち TTC のみを使用し、 アラニン(略号 : A )では4つある同義コドンのうち GCT を多用しています。

課題2 :

DNA複製開始にかかわっているDnaA タンパクをコードする遺伝子(dnaA)のコドン使用頻度 を計算し、先程のtufA 遺伝子の出力結果と比較してみましょう。 dnaA 遺伝子の CDS ID は、'CDS1'です。

[ヒント] 上記スクリプトの codon_usage($gb, -CDSid⇒'CDS113'); の行を書き換えます。

Step 3 ゲノムデータへのアクセス

G-language System 起動時に読み込まれたデータは、全て $gb の中に格納されています。 ここでは、$gb に格納されている各種ゲノム情報へのアクセスの仕方を簡単に説明します。

詳細については

perldoc G.pm  [ENTER] 

を実行し、G.pm のperldocドキュメンテーション(Prelude-manual)を参照して下さい。

さて、以下に今回使用したデータファイル("bsub.gbk")の一部を示します。

LOCUS AL009126 4214814 bp circular BCT 10-MAY-1999

DEFINITION  Bacillus subtilis complete genome. 
(中略) 
FEATURES             Location/Qualifiers 
   source          1..4214814 
                   /organism="Bacillus subtilis" 
                   /db_xref="taxon:1423" 
   gene            410..1750 
                   /gene="dnaA" 
   CDS             410..1750 
                   /gene="dnaA" 
                   /function="initiation of chromosome replication (DNA 
                   synthesis)" 
                   /note="alternate gene name: dnaH, dnaJ, dnaK" 
                   /codon_start=1 
                   /transl_table=11 
                   /db_xref="PID:e1181934" 
                   /db_xref="PID:g2632268" 
                   /translation="MENILDLWNQALAQIEKKLSKPSFETWMKSTKAHSLQGDTLTIT 
                   APNEFARDWLESRYLHLIADTIYELTGEELSIKFVIPQNQDVEDFMPKPQVKKAVKED 
                   TSDFPQNMLNPKYTFDTFVIGSGNRFAHAASLAVAEAPAKAYNPLFIYGGVGLGKTHL 
                   MHAIGHYVIDHNPSAKVVYLSSEKFTNEFINSIRDNKAVDFRNRYRNVDVLLIDDIQF 
                   LAGKEQTQEEFFHTFNTLHEESKQIVISSDRPPKEIPTLEDRLRSRFEWGLITDITPP 
                   DLETRIAILRKKAKAEGLDIPNEVMLYIANQIDSNIRELEGALIRVVAYSSLINKDIN 
                   ADLAAEALKDIIPSSKPKVITIKEIQRVVGQQFNIKLEDFKAKKRTKSVAFPRQIAMY 
                   LSREMTDSSLPKIGEEFGGRDHTTVIHAHEKISKLLADDEQLQQHVKEIKEQLK" 
(中略) 

BASE COUNT 1187757 a 919167 c 915023 g1192867 t ORIGIN

      1 atctttttcg gcttttttta gtatccacag aggttatcga caacattttc acattaccaa 

(中略)

4214761 ttacggaaaa aagacaaatt caaacaattt gcccctaaaa tcacgcatgt ggat 

$gb は LOCUS, HEADER, FEATURE1, FEATURE2, … , FEATURE8444, CDS1, CDS2, … , CDS4100, SEQ などの構造体を持ちます。 例えば、各CDSの情報は CDS1, CDS2, … , CDS4100(CDS+番号) という名前の 構造体に入っており、それぞれの情報には $gb→{CDS480}→{gene} のように階層的にアクセスします。 また、ORIGIN以降の全塩基配列は $gb→{SEQ} の中に入っています。 === 課題3 : === Step 0で作成したスクリプトに、'CDS1'の開始位置と終了位置を出力する 次の一行を書き込んで実行してください。 print "$gb→{CDS1}→{start}..$gb→{CDS1}→{end}"; そして、出力結果が上記データファイルに一致することを確認してください。 ====== Step 4-より高度な解析のために ====== G-language System にはゲノム解析関数が標準で多数用意されており、それらの 標準関数のみでも幅広い解析を行うことが可能です。しかし、実際の研究においては、 より高度な解析を行う場面も想定されます。そのためには、ある程度のプログラミング 能力は不可欠です。Perl初心者は、初心者用講座や新人勉強会などの テキストを参考にして下さい。 G-language System はゲノム解析のための関数だけでなく、ゲノムデータベースを 扱い易くするためのプラットフォームを提供します。そのプラットフォームとは、 $gb というG-language System のインスタンスから呼び出せる関数であり、 遺伝子毎の処理、開始コドン・終止コドン周辺の処理、イントロン・エキソン処理 など多岐に渡ります。 詳しくは、G.pm のperldocドキュメンテーション(Prelude-manual )を参照して下さい。 $gb→cds() は、$gb に格納されている全CDSのオブジェクト名を配列で返します。 例えば、課題2で作成したdnaA 遺伝子のコドン使用頻度解析用のスクリプトは、 $gb→cds() を使って以下のように書き換えても同じ結果が得られるはずです。 use G; $gb = new G("bsub.gbk"); foreach $cds ($gb→cds()){ if($gb→{$cds}→{gene} =~ /dnaA/){ codon_usage($gb, -CDSid⇒$cds); } } では、スクリプトの説明をしましょう。 (1) foreach文は次のような構造をしています。 foreach $variable (@array){ some process here. } 配列の要素が先頭から順に変数に代入され、代入されるたびに処理が行われます。よって foreach $cds ($gb→cds()){ 処理 } は、配列の要素(CDSのオブジェクト名)を順次 $cds という変数に代入して処理せよ という意味です。これは、G-language Systemにおいて遺伝子毎の処理をする基本的な方法の一つです。 (2) Perlでは正規表現と呼ばれる強力な表現を使うことができます。よくある使い方としては、 「ある正規表現は、ある文字列にマッチするか?」というものです。これは、変数 =~ /正規表現/ と記述します。 if($gb→{$cds}→{gene} =~ /dnaA/){ codon_usage($gb, -CDSid⇒$cds); } は、もし遺伝子名($gb→{$cds}→{gene})が"dnaA"にマッチするなら、そのCDSのコドン使用頻度を計算せよ という意味です。 ここで示した例は非常に簡単なものですが、より複雑な解析を効率よく容易に行うことができます。

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